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一起來(lái)探討一下ATCC細(xì)胞株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵因素

更新時(shí)間:2019-03-25      點(diǎn)擊次數(shù):1818
   ATCC細(xì)胞在培養(yǎng)瓶長(zhǎng)成致密單層后,已基本上飽和,為使細(xì)胞能繼續(xù)生長(zhǎng),同時(shí)也將細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)大,就必須進(jìn)行傳代(再培養(yǎng))。傳代培養(yǎng)也是一種將細(xì)胞種保存下去的方法。同時(shí)也是利用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)的必經(jīng)過(guò)程。懸浮型細(xì)胞直接分瓶就可以,而貼壁細(xì)胞需經(jīng)消化后才能分瓶。
  ATCC細(xì)胞株穩(wěn)定整合試驗(yàn)中的幾個(gè)關(guān)鍵因素:
  1),外源插入片段的拷貝數(shù)。多數(shù)情況下,低拷貝甚至是單拷貝可以減少人為實(shí)驗(yàn)因素的干擾。
  2),整合的幾率,這不僅決定了穩(wěn)定株篩選的難易程度,而且還可以幫助人們更容易得到混合穩(wěn)定株。
  3),整合位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄活躍度,決定了穩(wěn)定株中外源片段的表達(dá)質(zhì)量。理想的狀況是單拷貝,但轉(zhuǎn)錄活性比較高。
  4),整合后的穩(wěn)定性。不同的整合位點(diǎn)決定了外源片段在染色體中的穩(wěn)定性,有些區(qū)域易發(fā)生重組或者丟失,從而導(dǎo)致穩(wěn)定株再次丟失的情況。
  5),使用混合穩(wěn)定株或者獲得多個(gè)不同單克隆穩(wěn)定株。因?yàn)榉€(wěn)定整合往往伴隨這插入失活宿主內(nèi)源基因,所以實(shí)驗(yàn)時(shí)通過(guò)使用混合穩(wěn)定株,或者對(duì)多個(gè)單克隆穩(wěn)定株進(jìn)行比較,可以幫助研究人員獲得更的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
  凍存的ATCC細(xì)胞株和雜交腐細(xì)胞株在運(yùn)送過(guò)程中使用干冰保持低溫。收到細(xì)胞后,可以立即解凍復(fù)蘇,去除二甲基亞砜(DSMO0)后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。如果不立即復(fù)蘇培養(yǎng)細(xì)胞,必須將細(xì)胞凍存管放置于液氮罐氣相層儲(chǔ)存。請(qǐng)不要將細(xì)胞存儲(chǔ)在-130℃以上的溫度。如果溫度不夠低,達(dá)不到-130℃,細(xì)胞活力會(huì)立即下降。
  ATCC細(xì)胞的培養(yǎng)試劑分析:
  一、紡錘體阻斷劑
  在有絲分裂過(guò)程中,隨著紡錘絲的形成,染色體被牽引到一起難以觀察其形態(tài)。紡錘體的形成在于細(xì)胞質(zhì)和紡錘體成分的粘度之間的平衡,因此,改變細(xì)胞質(zhì)的粘度,即可破壞紡錘體形成,從而使得染色體均勻散開,且染色體縊痕區(qū)更為清楚。
  在培養(yǎng)中使用的紡錘體阻斷劑為秋水仙素,在終止培養(yǎng)前加入適量秋水仙素,使正在分裂的細(xì)胞停留在中期,以獲得大量分裂相供分析之用。秋水仙素的濃度范圍比較寬,一般使用濃度0.05-0.8微克/毫升,在終止培養(yǎng)前處理2-4小時(shí)。但在實(shí)際工作中需要借助濃度和處理時(shí)間來(lái)控制染色體的收縮程度。秋水仙素作用時(shí)間越長(zhǎng),被阻斷的中期分裂相越多,但是染色體也越凝聚和收縮,所以還視各實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)而定。
  二、ATCC細(xì)胞低滲液
  低滲液是指滲透壓和離子強(qiáng)度均低于正常細(xì)胞生理?xiàng)l件的溶液,如水、低滲的檸檬酸鈉或氯化鈉、甘油磷酸鉀(0.65M)、KCl(0.075M)等。低滲效果取決于低滲液的化學(xué)組成、低滲的溫度和處理時(shí)間。低滲處理是憑借反滲透作用使細(xì)胞膨脹染色體鋪展,同時(shí)可使粘附于染色體的核仁物質(zhì)散開,以便能在一個(gè)平面上觀察所有染色體形態(tài)。實(shí)驗(yàn)室中一般選用0.075MKCl為低滲液(具體情況取決于實(shí)際操作,鑒于實(shí)驗(yàn)的連續(xù)性和穩(wěn)定性,本實(shí)驗(yàn)室采用0.35%KCl),其優(yōu)點(diǎn)有:
  1.染色體輪廓清楚,可染色性強(qiáng),染色時(shí)間短。
  2.用于顯帶染色時(shí)能充分顯示帶型特點(diǎn)。低滲處理為37℃,15-25分鐘,以預(yù)實(shí)驗(yàn)條件為準(zhǔn)。
  三、固定液
  固定液的重要特性是能迅速穿透細(xì)胞,將其固定并維持染色體結(jié)構(gòu)的完整性,還要能夠增強(qiáng)染色體的嗜堿性,達(dá)到優(yōu)良染色效果。單純的固定液一般難以達(dá)到這些要求,因此在實(shí)驗(yàn)中使用兩種混和的固定液。
  Carnoy固定液(甲醇:冰乙酸=3:l)每次使用前需臨時(shí)配制,長(zhǎng)時(shí)間放置影響固定效果,固定時(shí)間15分鐘至24小時(shí),冰箱、室溫均可。必要時(shí)可改變甲醇和冰乙酸的比例,冰乙酸比例增加,利于細(xì)胞膨脹、染色體鋪展,但易導(dǎo)致細(xì)胞破裂、染色體散失。
  四、滴片
  滴片使細(xì)胞懸液從一定高處落在載玻片上,淋巴母細(xì)胞膜破裂,染色體分散開。載玻片可用冰片和干片,效果均好。滴片后需空氣干燥。
  五、Giemsa染色
  Giemsa染料不是一種單一染料,而是天青、伊紅、甘油和甲醇的混合物,配制后原液儲(chǔ)存。在常規(guī)染色中,并不比其他染料*,但在顯帶技術(shù)中,卻是*的。
  Giemsa工作液在使用前臨時(shí)配制,濃度可在2.5-10%之間(原液2份加pH7.4磷酸緩沖液10-40份)。染色后,染色質(zhì)呈紅色,細(xì)胞核是藍(lán)色。
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